Cell cycle progression is coordinated with metabolism, signaling and other complex cellular functions. The investigation of cellular processes in a cell cycle stage-dependent manner is often the subject of modern molecular and cell biological research. Cell cycle synchronization and immunostaining of cell cycle markers facilitate such analysis, but are limited in use due to unphysiological experimental stress, cell type dependence and often low flexibility. Here, we describe high-content microscopy-assisted cell cycle phenotyping (hiMAC), which integrates high-resolution cell cycle profiling of asynchronous cell populations with immunofluorescence microscopy. hiMAC is compatible with cell types from any species and allows for statistically powerful, unbiased, simultaneous analysis of protein interactions, modifications and subcellular localization at all cell cycle stages within a single sample. For illustration, we provide a hiMAC analysis pipeline tailored to study DNA damage response and genomic instability using a 3−4- day protocol, which can be adjusted to any other cell cycle stage-dependent analysis.
细胞周期进程协调着细胞生理代谢、信号传导等复杂生物学功能。解析细胞周期特异的生物学机制是现代分子细胞生物学研究的一个热点。通常,为鉴别不同细胞周期需通过药物来诱导细胞周期同步化并对细胞采用细胞周期特异分子进行免疫荧光染色。但是,细胞同步化药物对细胞造成的非生理性损伤,不同类型细胞对药物敏感性的差异,加之细胞周期特异性抗体在实验选择和应用上的局限,均妨碍精准研究细胞活性及机制。在本研究中,我们创建了一种高通量细胞周期分析方法(hiMAC,全称为高通量显微细胞周期分析术)。该技术可在非同步化细胞中,通过免疫荧光显微镜技术实现高分辨率细胞周期分析。hiMAC技术可以运用在各种细胞类型中, 对同一样品和多样本同步在不同细胞周期进行蛋白-蛋白相互作用、蛋白质修饰及其亚细胞定位等检测,并且可对结果进行高效的统计学分析。基于该技术平台,我们开发了分析程序包,可以在3-4天内完成对不同细胞周期中细胞DNA损伤应答反应和基因组稳定性分析。同时,该程序包也适用于其他细胞周期特异性的功能研究。
Der Zellzyklus wird mit Signaltransduktionswegen, Stoffwechsel, und anderen komplexen Zellfunktionen koordiniert. Die Aufklärung mechanistischer Zusammenhänge zwischen Zellzyklusphase und verschiedenen zellulären Vorgängen ist das Ziel vieler molekularer und zellbiologischer Studien. Zellzyklus-Synchronisation und Immunfärbung von Zellzyklusmarkern ermöglichen derartige Analysen, sind jedoch in ihrem Nutzen begrenzt durch die Induktion von unphysiologischem experimentellen Stress, durch die Abhängigkeit vom untersuchten Zelltyp, und oft durch geringe Flexibilität. Hier beschreiben wir „high-content microscopy-assisted cell cycle phenotyping“ (hiMAC), eine Methode, welche die Generierung hochauflösender Zellzyklus-Profile von asynchronen Zellpopulationen mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie zusammenführt. hiMAC ist mit Zelltypen beliebiger Spezies kompatibel und ermöglicht statistisch aussagekräftige, objektive und simultane Analysen der Interaktion, Modifikation und subzellulären Lokalisierung von Proteinen in allen Zellzyklusphasen in einer einzigen Probe. Zur Veranschaulichung stellen wir eine hiMAC Pipeline zur Verfügung, welche auf die Analyse der DNA-Schadensantwort und der genomischen Instabilität in einem 3-4-Tage-Protokoll zugeschnitten ist und auf beliebige andere Zellzyklus-abhängige Analysen angepasst werden kann.